La pregabalina no es un agonista de los receptores GABAA o GABAB.
La pregabalina es un gabapentinoide y actúa inhibiendo ciertos canales de calcio. Específicamente, es un ligando del sitio de la subunidad α2δ auxiliar de ciertos canales de calcio dependientes de voltaje (VDCC) y, por lo tanto, actúa como un inhibidor de los VDCC que contienen la subunidad α2δ. Hay dos subunidades α2δ de unión al fármaco, α2δ-1 y α2δ-2, y la pregabalina muestra una afinidad similar por (y, por tanto, una falta de selectividad entre) estos dos sitios. La pregabalina es selectiva en su unión a la subunidad α2δ VDCC. A pesar de que la pregabalina es un análogo de GABA, no se une a los receptores GABA, no se convierte en GABA u otro agonista del receptor GABA in vivo y no modula directamente el transporte o el metabolismo de GABA. Sin embargo, se ha descubierto que la pregabalina produce un aumento dependiente de la dosis en la expresión cerebral de la descarboxilasa del ácido L-glutámico (GAD), la enzima responsable de sintetizar GABA, y por lo tanto puede tener algunos efectos GABAérgicos indirectos al aumentar los niveles de GABA en el cerebro. Actualmente no hay evidencia de que los efectos de la pregabalina estén mediados por algún mecanismo distinto de la inhibición de los VDCC que contienen α2δ. De acuerdo, la inhibición de los VDCC que contienen α2δ-1 por la pregabalina parece ser responsable de sus efectos anticonvulsivos, analgésicos y ansiolíticos.
Los α-aminoácidos endógenos L-leucina y L-isoleucina, que se parecen mucho a la pregabalina y los otros gabapentinoides en su estructura química, son ligandos aparentes de la subunidad α2δ VDCC con afinidad similar a la de los gabapentinoides (p. ej., IC50 = 71 nM para L- isoleucina), y están presentes en el líquido cefalorraquídeo humano en concentraciones micromolares (p. ej., 12,9 μM para L-leucina, 4,8 μM para L-isoleucina). Se ha teorizado que pueden ser los ligandos endógenos de la subunidad y que pueden antagonizar competitivamente los efectos de los gabapentinoides. De acuerdo, si bien los gabapentinoides como la pregabalina y la gabapentina tienen afinidades nanomolares por la subunidad α2δ, sus potencias in vivo están en el rango micromolar bajo y se ha dicho que la competencia por la unión de los L-aminoácidos endógenos probablemente sea responsable de esta discrepancia.

En un estudio se descubrió que la pregabalina posee una afinidad 6 veces mayor que la gabapentina por los VDCC que contienen la subunidad α2δ. Sin embargo, otro estudio encontró que la pregabalina y la gabapentina tenían afinidades similares por la subunidad α2δ-1 recombinante humana (Ki = 32 nM y 40 nM, respectivamente). En cualquier caso, la pregabalina es de 2 a 4 veces más potente que la gabapentina como analgésico y, en animales, parece ser de 3 a 10 veces más potente que la gabapentina como anticonvulsivo.